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气相色谱法和高效液相色谱法

Gas Chromatography and High Performance Liquid Chromatography

色谱法是一种极有效的分离、分析多组分混合物的物理化学分析方法。本章讨论气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC），它们在理论基础、定性鉴定和定量计算方面相同，但流动相分别为气体和液体。

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气相色谱 GC
💧
液相色谱 HPLC
📊
塔板理论
🔬
多种检测器

§11-1 色谱分析理论基础

一、色谱法概述

色谱法又名层析法、色层法，是俄国植物学家茨维特（Tswett）于1906年首先提出的。他在研究植物叶色素成分时，使用竖直玻璃管内充填碳酸钙，将植物叶的石油醚浸取液加入后用纯石油醚淋洗，使不同色素在柱内分离形成不同颜色的谱带。

色谱法基本术语

  • 色谱柱：起分离作用的柱
  • 固定相（stationary phase）：固定在柱内的填充物
  • 流动相（mobile phase）：沿着柱流动的流体

色谱仪流程

流动相输送系统
→
试样装置
→
色谱柱
→
检测器
→
数据记录与处理

二、色谱分析基本原理

色谱法利用不同物质在流动相和固定相两相间的分配系数不同，当两相做相对运动时，试样中各组分在两相中经过反复多次的分配，从而使分配系数仅有微小差异的各组分能够彼此分离。

分配系数 K（partition coefficient）
K = cS / cM

cS：组分在固定相中的浓度；cM：组分在流动相中的浓度

分配比 k（partition ratio / capacity factor）
k = mS / mM = K · (VS / VM) = K / β

mS、mM：组分在两相中的质量；β：相比

三、色谱流出曲线及有关术语

tM tR 时间 →
1
保留时间 tR
待测组分从进样到色谱峰出现最大值时所需的时间
2
死时间 tM
不与固定相作用的物质（如空气、甲烷）的保留时间
3
调整保留时间 t'R = tR - tM
扣除死时间的保留时间
4
相对保留值 r21 = t'R2 / t'R1
只与柱温及固定相性质有关，表示固定相的选择性

区域宽度表示方法

标准偏差 σ

0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半

半峰宽 W1/2

W1/2 = 2.35σ，峰高一半处的宽度

峰宽 W

W = 4σ，通过拐点切线在基线的截距

保留指数 I

Kovats指数，用正构烷烃标定

四、塔板理论——柱效能指标

马丁（Martin）等人把色谱分离过程比作分馏过程，提出了塔板理论。把色谱柱比作分馏塔，柱内有若干想象的塔板，在每个塔板高度间隔内，被分离组分在气、液两相间达成分配平衡。

塔板理论示意图

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...
n

每个塔板内达到一次分配平衡，n越大分离效果越好

理论塔板数 n
n = 5.54(tR/W1/2)² = 16(tR/W)²
有效塔板数 neff
neff = 5.54(t'R/W1/2)² = 16(t'R/W)²

五、速率理论——色谱动力学理论

1956年，荷兰学者范·第姆特（van Deemter）等人提出了速率理论，对色谱分离过程中引起色谱峰展宽的动力学因素进行了归纳。

H = A + B/u + Cu
A
涡流扩散项
A = 2λdp
与填充物粒径和均匀性有关
B/u
分子扩散项
B = 2γDg
纵向扩散，与流速成反比
Cu
传质阻力项
C = Cg + Cl
气相和液相传质阻力

六、分离度

分离度 R（resolution）
R = 2(tR2 - tR1) / (W1 + W2)

R = 1：两峰分离达98%；R = 1.5：分离达99.7%（完全分离）

分离度与柱效能、相对保留值的关系
R = (1/4)√neff · (r21 - 1) / r21

§11-2 色谱定性与定量分析方法

一、色谱定性分析方法

1. 利用保留值的定性分析方法

当固定相和操作条件严格固定不变时，每种物质都有确定的保留值。如待测组分的保留值与在相同条件下测得的纯物质的保留值相同，则可初步认为它们是同一物质。

双柱定性法：用两根装填不同极性固定液的色谱柱进样分析，如果在两根柱上保留值都相同，则定性结果的可靠程度大为提高。

2. 与其它方法结合的定性方法

GC-MS

气相色谱-质谱联用，是目前解决复杂未知物定性问题的有效工具

LC-MS

液相色谱-质谱联用，广泛应用于蛋白质组学、代谢组学研究

GC-FTIR

气相色谱-傅里叶变换红外光谱联用

LC-NMR

液相色谱-核磁共振波谱联用

二、色谱定量分析方法

定量测定依据
mi = fi · Ai

mi：组分质量；fi：定量校正因子；Ai：峰面积

1. 峰面积的测量

A = 1.065 h · W1/2

2. 定量校正因子

相对质量校正因子
f'i = fi/fs = (mi/Ai)/(ms/As) = (mi·As)/(ms·Ai)

3. 常用定量方法

适用条件：试样中所有组分都能流出色谱柱，且在色谱图上都显示色谱峰

wi = (f'i·Ai / Σf'i·Ai) × 100%

优点：简便、准确，即使进样量不准确对结果亦无影响

适用条件：试样中所有组分不能全部出峰，或仅需测定其中某个或某几个组分

wi = (ms·f'i·Ai) / (m样·As) × 100%

内标物要求：试样中不存在的纯物质，加入量应接近待测组分的量

优点：定量准确，试样中含有不出峰的组分时亦能应用

方法：取纯物质配制成一系列不同浓度的标准溶液，做出峰面积和浓度的关系曲线

wi/ws = Ai/As

优点：操作和计算都简便

缺点：要求操作条件稳定，进样量重复性好

§11-3 气相色谱法概述

气相色谱法的特点

🎯 分离效能高

能分离、分析很复杂的混合物（如石油馏分中的几十个、上百个组分）或性质极相近似的物质（如同系物、异构体等）

🔍 灵敏度高

可以检测出10⁻¹¹～10⁻¹³ g的物质，在环境监测中可直接分析痕量组分

⚡ 分析快速

一般在几分钟或几十分钟内，可完成一个组成较复杂试样的分析

📋 应用范围广

分析对象可以是在柱温条件下能汽化的有机试样或无机试样，沸点一般不超过500°C

气相色谱法适合分析可挥发、热稳定的物质，约占有机物总数的15%～20%。不适合分析难挥发物质和热不稳定物质。

气相色谱分析流程

载气高压钢瓶
→
减压阀
→
净化干燥管
→
汽化室
→
色谱柱
→
检测器
→
记录系统

气相色谱仪五大组成部分

  1. 载气系统（气源、气体净化、流速控制和测量）
  2. 进样系统（手动或自动进样器、汽化室）
  3. 色谱柱
  4. 检测器
  5. 记录系统（放大器、记录仪或色谱工作站）

§11-4 气相色谱固定相

一、气-固色谱固定相

气-固色谱一般用表面具有活性的吸附剂作固定相。

吸附剂 主要成分 极性 应用
活性炭 C 非极性 惰性气体、N₂、CO₂、CH₄等气体
石墨化炭黑 C 非极性 分离气体、烃类及部分含氧有机物
硅胶 SiO₂·xH₂O 氢键型 一般气体、CCl₄、烷烃类
分子筛 硅铝酸盐 极性 永久性气体和惰性气体的分离
高分子多孔微球 聚合物 弱/中极性 有机物中痕量水分测定

二、气-液色谱固定相

气-液色谱固定相由担体和固定液组成。

1. 担体

担体要求

  • 比表面积大，孔径分布均匀
  • 化学惰性好，与被分离组分不起化学反应
  • 热稳定性好，有一定的机械强度
  • 颗粒均匀，大小适度（常用60～80目、80～100目）

红色担体

表面孔穴密集，孔径较小，表面积较大，机械强度较好。适于非极性或弱极性试样分离。

白色担体

表面孔径较大，表面积较小，吸附性小。适于分离极性试样。

2. 固定液及其选择

固定液一般是高沸点的有机化合物，选择应遵循"相似相溶"原则。

固定液选择指南

1
分离非极性组分：选用非极性固定液（如角鲨烷）
各组分按沸点次序流出
2
分离极性组分：选用极性固定液（如聚乙二醇）
各组分按极性大小顺序流出，极性小的先出峰
3
分离非极性和极性混合物：选用极性固定液
非极性组分先出峰
4
分离能形成氢键的组分：选择极性或氢键型固定液
不易形成氢键的先流出
5
复杂难分离组分：采用特殊固定液或混合固定液
如液晶固定液用于位置异构体分离

§11-5 气相色谱检测器

检测器的作用是将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电信号。

响应值（灵敏度）S
E = S · m   或   A = S · mi

浓度型检测器

响应信号与进入检测器的组分浓度成正比

例：热导检测器（TCD）

质量型检测器

响应信号与单位时间内进入检测器的组分质量成正比

例：氢火焰离子化检测器（FID）

常用检测器

热导检测器TCD

基于不同气体或蒸气具有不同的热导系数原理

  • 结构简单，灵敏度适中
  • 稳定性好，线性范围宽
  • 对有机物和无机物均有响应
  • 属浓度型检测器
  • 宜选用H₂或He作载气

氢火焰离子化检测器FID

有机物在氢火焰中发生化学电离产生离子电流

  • 灵敏度很高（10⁻¹¹ g·mL⁻¹）
  • 比TCD高近3个数量级
  • 线性范围宽，稳定性好
  • 对永久性气体、水等无响应
  • 属质量型检测器

电子俘获检测器ECD

电负性物质俘获低能电子产生负离子

  • 高选择性、高灵敏度
  • 可测10⁻¹⁴ g·mL⁻¹强电负性物质
  • 对卤素、硫、磷、氧化合物敏感
  • 常用于农药残留分析
  • 属浓度型检测器

火焰光度检测器FPD

含硫/磷化合物在富氢焰中发射特征光

  • 对含硫、磷化合物高选择性
  • 硫化合物特征波长：394 nm
  • 磷化合物特征波长：528 nm
  • 用于石油中硫化物测定
  • 用于农药残留分析

§11-6 气相色谱操作条件的选择

一、载气种类及流速的选择

  • 载气流速小时：分子扩散项影响主要，选用摩尔质量大的气体（N₂、Ar）
  • 载气流速大时：传质阻力项影响主要，选用摩尔质量小的气体（H₂、He）
  • 存在最佳流速使塔板高度H最小

二、柱温的选择

  • 柱温应低于固定液的最高使用温度
  • 柱温过高：K值减小，分离变差
  • 柱温过低：传质速率降低，分析时间延长
  • 沸点<300°C的试样：柱温比平均沸点低20～30°C
  • 宽沸程试样：采用程序升温

三、柱长和柱内径的选择

分离度R正比于柱长的平方根，增加柱长对分离有利，但柱长增加使分析时间延长。一般最常用的柱长为1～3 m，常用填充柱内径为3～4 mm。

四、进样量和进样时间的选择

  • 液体试样：0.1～5 μL
  • 气体试样：0.1～10 mL
  • 进样速度必须很快，在1 s内完成
  • 以"塞子"形式进样，有利于分离

五、汽化温度的选择

一般较柱温高30～70°C，但汽化温度不宜过高，以防试样分解。

§11-7 毛细管气相色谱法简介

毛细管色谱柱的固定相附着于管内壁，管中间留有载气通道，又称开管柱。

WCOT

壁涂开管柱（Wall Coated Open Tubular）
将固定液涂于毛细管内壁上

PLOT

多孔层开管柱（Porous Layer Open Tubular）
管壁涂多孔性吸附剂固体微粒

SCOT

载体涂渍开管柱（Support Coated Open Tubular）
内壁涂多孔颗粒再涂固定液

交联/键合柱

固定液分子交联或化学键合
减少流失，延长寿命

毛细管柱的优点

  • 中空，无涡流扩散（A项为零）
  • 内径小（0.1～0.53 mm），传质阻力大为减小
  • 每米理论塔板数可达3000～4000
  • 柱长可达20～100 m
  • 总理论塔板数可达10⁵～10⁶（填充柱的10～100倍）
毛细管柱容量很小，需要采用分流进样技术和高灵敏度检测器（如FID）。

§11-8 高效液相色谱法概述

高效液相色谱法（HPLC）又称高压液相色谱法、高速液相色谱法或现代液体色谱，是20世纪70年代飞速发展起来的一种新颖、快速的分离分析技术。

HPLC的特点

⚡ 高压

柱前压力一般可达100×10³～350×10³ Pa

🚀 高速

分析时间一般为数分钟到数十分钟

📊 高效

柱效能按单位长度塔板数比GC更高

🔬 高灵敏度

最小检测量可达10⁻⁹ g，甚至10⁻¹² g

HPLC与GC的主要区别

二者主要的区别是流动相不同。液体的密度是气体的一千倍，黏度是气体的一百倍，扩散系数为气体的万分之一至十万分之一。

  • 分子扩散项可以忽略不计
  • 传质阻力是使色谱峰扩展的主要原因
  • 需采用粒度细小且填充均匀的固定相

应用范围

HPLC可用于高沸点、离子型、热不稳定物质的分析。沸点500°C以下、相对分子质量400以下的有机物约占有机物总数的15%～20%可用GC分析，而其余的80%～85%原则上都可采用HPLC分析。

§11-9 高效液相色谱仪

贮液器
→
高压泵
→
梯度洗提装置
→
进样器
→
色谱柱
→
检测器
→
数据处理

主要部件

1. 高压泵

输出压力达400×10³～500×10³ Pa，流量稳定，压力平稳无脉动。一般采用往复泵。

2. 梯度洗提

按一定程序连续改变流动相中不同极性溶剂的配比，以连续改变流动相的极性，作用类似于GC中的程序升温。

3. 色谱柱

  • 标准柱型：内径3.9或4.6 mm，长10～30 cm
  • 填料颗粒度：3～5 μm
  • 理论塔板数：每米10⁴～10⁵
  • UPLC：颗粒度<2 μm，柱内径2.1 mm

4. 检测器

紫外光度检测器UV

  • 灵敏度高（10⁻⁹ g·mL⁻¹）
  • 对温度和流速不敏感
  • 可用于梯度洗提
  • 检测波长200～600 nm可选

荧光检测器FL

  • 灵敏度比UV高2～3个数量级
  • 选择性好
  • 适于多环芳烃、维生素等分析
  • 线性范围较差

示差折光检测器RI

  • 通用型检测器
  • 灵敏度较低（10⁻⁷ g·mL⁻¹）
  • 对温度敏感（±10⁻⁴ °C）
  • 不能用于梯度洗提

电导检测器EC

  • 用于可电离化合物检测
  • 灵敏度高（10⁻⁹ g·mL⁻¹）
  • 离子色谱法最常用检测器
  • 需严格控制温度

§11-10 高效液相色谱法的主要分离类型

液-液分配色谱法

固定相由担体与涂覆的固定液组成，试样在流动相与固定液之间进行溶解和分配。

正相色谱：流动相极性弱于固定液

反相色谱：流动相极性强于固定液

化学键合相色谱法

通过化学反应把有机分子键合到硅胶颗粒表面，最常用的是十八烷基键合硅胶（ODS）。

已成为目前应用最广的分离模式，占HPLC应用的70%左右。

离子交换色谱法

采用离子交换树脂作固定相，以含酸碱、盐的水溶液作流动相。

离子色谱法（IC）：增加抑制柱消除本底电导干扰，大大提高检测灵敏度。

空间排阻色谱法

以凝胶为固定相，利用孔径大小的不同，按分子体积大小进行分离。

大分子先流出，小分子后流出。适用于相对分子质量>1000的化合物。

流动相的选择

溶剂按极性增强次序排列：正己烷 < 环己烷 < 四氯化碳 < 甲苯 < 氯仿 < 乙醚 < 乙酸乙酯 < 正丁醇 < 丙酮 < 乙醇 < 甲醇 < 水 < 乙酸

正相色谱流动相

以正己烷或正庚烷为主体，加入弱极性溶剂调节

反相色谱流动相

以水为主体，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等有机溶剂

分离类型的选择

  • 相对分子质量>2000：空间排阻色谱法
  • 溶于戊烷：液-固吸附色谱
  • 溶于三氯甲烷：正相色谱和吸附色谱
  • 溶于甲醇或水：反相色谱
  • 离子型化合物：离子色谱法或离子对色谱法
  • 异构体分离：吸附色谱
  • 同系物分离：分配色谱

思考题与习题

思考题

按流动相：气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、超临界流体色谱（SFC）

按固定相：气-固色谱、气-液色谱、液-固色谱、液-液色谱

气相色谱柱的理论塔板数很大，组分在固定相和流动相间经过成千上万次的分配平衡，使分配系数仅有微小差异的组分也能彼此分离。

分离度R更全面。R包含了热力学因素（保留时间差，与分配系数有关）和动力学因素（峰宽），而相对保留值仅反映热力学因素。

说明影响塔板高度（柱效能）的因素：涡流扩散（A）、分子扩散（B/u）和传质阻力（Cu）。指导色谱分离操作条件的选择和高效色谱柱的制备。

计算题

色谱图上有两个色谱峰，保留时间和峰底宽分别为：

tR1=3 min 20 s，tR2=3 min 50 s，W1=16 s，W2=19 s，tM=20 s

求相对保留值r21和分离度R。

分析某试样时，两种组分的相对保留值r21=1.16，柱的有效塔板高度Heff=1 mm。需要多长的色谱柱才能将两组分完全分离（即R=1.5）？

测得石油裂解气各组分的校正因子和峰面积如下，用归一化法求各组分的质量分数：

组分H₂O₂N₂CH₄COCO₂C₂H₄C₂H₆
f'0.421.001.000.841.001.200.740.74
A/cm²0.500.202.004.001.801.200.900.28

有一试样含有甲酸、乙酸、丙酸及水、苯等物质。称取试样1.055 g，以环己酮作内标，称取0.1907 g环己酮加到试样中。

已知各组分的相对响应值S：甲酸0.261，乙酸0.562，丙酸1.00，环己酮0.938

峰面积：甲酸14.8，乙酸72.6，丙酸133，环己酮91.5

求甲酸、乙酸、丙酸的质量分数。

英汉对照词汇

gas chromatography (GC) 气相色谱法
high performance liquid chromatography (HPLC) 高效液相色谱法
stationary phase 固定相
mobile phase 流动相
partition coefficient 分配系数
partition ratio / capacity factor 分配比/容量因子
retention time 保留时间
dead time 死时间
retention volume 保留体积
relative retention value 相对保留值
plate theory 塔板理论
theoretical plate number 理论塔板数
rate theory 速率理论
van Deemter equation 范·第姆特方程
eddy diffusion 涡流扩散
longitudinal diffusion 纵向扩散
mass transfer resistance 传质阻力
resolution 分离度
thermal conductivity detector (TCD) 热导检测器
flame ionization detector (FID) 氢火焰离子化检测器
electron capture detector (ECD) 电子俘获检测器
flame photometric detector (FPD) 火焰光度检测器
carrier gas 载气
support / carrier 担体
capillary column 毛细管柱
packed column 填充柱
gradient elution 梯度洗提
normal phase chromatography 正相色谱
reverse phase chromatography 反相色谱
ion exchange chromatography 离子交换色谱
ion chromatography (IC) 离子色谱
size exclusion chromatography 空间排阻色谱
chemically bonded phase 化学键合相
octadecylsilyl (ODS) 十八烷基硅烷
normalization method 归一化法
internal standard method 内标法
external standard method 外标法

复习本章的指导提纲

基本概念

色谱法、固定相、流动相、分配系数、分配比、保留值、塔板理论、速率理论、分离度、归一化法、内标法、外标法、梯度洗提、正相色谱、反相色谱、离子色谱、空间排阻色谱。

基本知识点

  • 色谱法的分类及基本原理
  • 分配系数、分配比的意义及计算
  • 保留值的各种表示方法
  • 塔板理论与理论塔板数的计算
  • 速率理论（范·第姆特方程）及各项的物理意义
  • 分离度的概念与计算
  • 色谱定性和定量分析方法
  • 气相色谱的特点、流程和应用
  • 气相色谱固定相的选择原则
  • 各种检测器的原理和应用特点
  • 气相色谱操作条件的选择
  • 毛细管气相色谱的特点
  • 高效液相色谱的特点和应用
  • HPLC的各种分离类型及选择