§9-1 概述
基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光（或分光）光度法，包括比色法、可见分光光度法（visible spectrophotometry）及紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）等。本章重点讨论可见分光光度法。
- 灵敏度较高，检测下限达 10⁻⁶ mol·L⁻¹
- 某些新技术如催化分光光度法，检测下限可达 10⁻⁸ mol·L⁻¹
- 相对标准偏差为 2%~5%，可满足微量组分测定对精确度的要求
- 仪器价格便宜，操作简单，应用广泛
- 可用于化学平衡等的研究
含铁 0.001% 的试样，若用滴定法测定，称量 1 g 试样，用 1.6×10⁻³ mol·L⁻¹ K₂Cr₂O₇ 标准溶液滴定，仅消耗 0.02 mL 滴定剂，与一般滴定管的读数误差（0.02 mL）相当，显然不能用滴定法测定。
但若在容量瓶中配成 50 mL 溶液，用 1,10-邻二氮菲显色，生成橙红色的邻二氮菲-亚铁配合物，就可以用吸光光度法来测定。
物质对光的选择性吸收
当光束照射到物体上时，光与物体发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。若被照射物系均匀溶液，则溶液对光的散射可以忽略。
可见光与颜色
不同波长的可见光呈现不同的颜色。当一束白光（由各种波长的光按一定比例组成）通过某一有色溶液时，一些波长的光被吸收，另一些波长的光透过。透射光（或反射光）刺激人眼而使人感觉到溶液的颜色。
由吸收光和透射光组成白光的两种光称为补色光，两种颜色互为补色。如硫酸铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈现蓝色，黄色与蓝色即为补色。
物质颜色与吸收光颜色的互补关系
| 物质颜色 | 吸收光颜色 | 吸收光波长/nm |
|---|---|---|
| 黄绿 | 紫 | 400~450 |
| 黄 | 蓝 | 450~480 |
| 橙 | 绿蓝 | 480~490 |
| 红 | 蓝绿 | 490~500 |
| 紫红 | 绿 | 500~560 |
| 紫 | 黄绿 | 560~580 |
| 蓝 | 黄 | 580~600 |
| 绿蓝 | 橙 | 600~650 |
| 蓝绿 | 红 | 650~780 |
光的吸收与能级跃迁
当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生"碰撞"，光子的能量被分子、原子或离子吸收，使这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态）：
被激发的粒子约在 10⁻⁸ s 后又回到基态，并以热或荧光等形式放出能量。仅当照射光的光子能量（hν）与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时才能发生吸收。不同的物质粒子由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同，所以物质对光的吸收具有选择性。
吸收光谱
让不同波长的单色光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下溶液对光的吸收程度（即吸光度 A），然后将 A 对波长 λ 作图，即可得吸收曲线（吸收光谱，absorption spectrum）。它描述了物质对不同波长光的吸收能力。
📈 吸收光谱可视化
图 9-3 邻二氮菲-亚铁溶液的吸收曲线
如图所示，邻二氮菲-亚铁的吸收曲线可见，该配合物对 510 nm 的绿色光吸收最多，有一吸收峰，相应的波长称最大吸收波长，用 λmax 表示。对波长 600 nm 以上的橙红色光几乎不吸收，完全透过，所以溶液呈橙红色。
光吸收的基本定律——朗伯-比尔定律
当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，光强度减弱。溶液的浓度 c 愈大，液层厚度 b 愈厚，入射光愈强，则光被吸收得愈多，光强度的减弱也愈显著。它是由实验观察得到的：
- A — 吸光度（absorbance）
- T — 透射率（transmittance）或称透光度，T = I/I₀
- I₀ — 入射光强度
- I — 透射光强度
- a — 比例常数，称为吸收系数
- b — 液层厚度，通常以 cm 为单位
- c — 溶液浓度
摩尔吸收系数 κ
如果 c 以 mol·L⁻¹ 为单位，则此时的吸收系数称为摩尔吸收系数（molar absorptivity），用符号 κ 表示，单位为 L·mol⁻¹·cm⁻¹。于是式（9-1）可表示为
κ 是吸光物质在特定波长和溶剂情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为 1 mol·L⁻¹ 吸光物质在 1 cm 光程中的吸光度，是物质吸光能力大小的量度。
- 可作为定性鉴定的参数
- 可用以估计定量方法的灵敏度：κ 值愈大，方法愈灵敏
- κ 与 a（质量吸收系数）的关系：κ = Ma（M 为物质的摩尔质量）
吸光度的加和性
在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性：
🧮 朗伯-比尔定律计算器
铁(Ⅱ)质量浓度为 5.0×10⁻⁴ g·L⁻¹ 的溶液，与 1,10-邻二氮菲反应，生成橙红色配合物，最大吸收波长为 508 nm。比色皿厚度为 2 cm 时，测得该显色溶液的 A = 0.19。计算邻二氮菲-亚铁比色法对铁的 a 及 κ。
已知铁的摩尔质量为 55.85 g·mol⁻¹。根据朗伯-比尔定律得：
a = A/(bc) = 0.19/(2 cm × 5.0×10⁻⁴ g·L⁻¹) = 190 L·g⁻¹·cm⁻¹
κ = Ma = 55.85 g·mol⁻¹ × 190 L·g⁻¹·cm⁻¹ = 1.1×10⁴ L·mol⁻¹·cm⁻¹
偏离朗伯-比尔定律的原因
分光光度定量分析常需要绘制标准曲线。根据朗伯-比尔定律，标准曲线应是通过原点的直线。但在实际工作中，特别是当溶液浓度较高时，常会出现标准曲线不为直线的现象，这称为偏离朗伯-比尔定律。
📉 标准曲线偏离示意图
图 9-4 光度分析工作曲线
1. 非单色光引起的偏离
朗伯-比尔定律的基本假设是入射光为单色光，但目前仪器所提供的入射光实际上是由波长范围较窄的光带组成的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度不同，因而引起对朗伯-比尔定律的偏离。
选用 λmax 处的光作入射光，因为在 λmax 附近 κ 变化不大，所引起的偏离就小，标准曲线基本上是直线。
2. 化学因素引起的偏离
朗伯-比尔定律除要求单色入射光外，还假设吸光粒子彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。在高浓度时（通常 c > 0.01 mol·L⁻¹），由于吸光粒子间的平均距离减小，以致每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布，这种相互作用可使它们的吸光能力发生改变。
化学平衡变化
由吸光物质等构成的溶液化学体系，常因条件的变化而发生吸光组分的缔合、解离、互变异构、配合物的逐级形成以及与溶剂的相互作用等，从而形成新的化合物或改变吸光物质的浓度，都将导致偏离朗伯-比尔定律。
实例：重铬酸钾
重铬酸钾在水溶液中存在如下平衡：
Cr₂O₇²⁻ + H₂O ⇌ 2H⁺ + 2CrO₄²⁻
如果稀释溶液或增大溶液 pH，部分 Cr₂O₇²⁻ 就转变成 CrO₄²⁻，吸光质点发生变化，从而引起偏离。
§9-2 分光光度计及其基本部件
吸光度测定使用的分光光度计（spectrophotometer）有紫外-可见分光光度计和可见分光光度计之分，种类和型号也繁多。按光路结构来说，可分为单波长单光束分光光度计、单波长双光束分光光度计、双波长分光光度计。
单波长单光束分光光度计
💡
🔷
📦
📊
图 9-6 单波长单光束分光光度计结构示意图
主要部件介绍
要求能够在所需波长范围内发出强而稳定的连续光谱。
- 可见光区：常用钨丝灯作光源，发射 320~2500 nm 波长的连续光谱
- 近紫外区：常采用氢灯或氘灯作光源，发射 180~375 nm 的连续光谱
- 钨丝灯工作温度一般为 2600~2870 K（钨的熔点为 3680 K）
单色器由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成。常用的滤光片也起一定的滤光作用。
棱镜单色器
光通过入射狭缝，经准直透镜以一定角度射到棱镜上，在棱镜的两界面上发生折射而色散。玻璃棱镜对 400~1000 nm 波长的光色散较大，适用于可见分光光度计。
光栅单色器
有透射光栅和反射光栅之分。光栅是在一抛光的金属表面上刻划一系列等距离的平行刻槽。使用棱镜单色器可以获得半宽度为 5~10 nm 的单色光，光栅单色器可获得半宽度小至 0.1 nm 的单色光。
亦称比色皿，用于盛放测光试液。吸收池本身应能透过所需波长的光线。
- 可见光区可用无色透明、能耐腐蚀的玻璃吸收池
- 紫外光区使用石英吸收池
- 有液层厚度为 0.5 cm、1 cm、2 cm、3 cm 等的一套长方形吸收池
- 同厚度吸收池间的透光度相差应小于 0.5%
- 应注意保持吸收池的清洁，指纹、油腻或其它沉积物都会影响吸收池透射特性
光电检测器将光强度转换成电流来测量吸光度。检测器对测定波长范围内的光应有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。
光电管
由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空二极管。电流一般为 2~25 μA。
光电倍增管
具有很高的灵敏度，响应快，是检测弱光最常用的光电元件，多用在精密的分光光度计上。
光电二极管阵列
硅材料的光电二极管检测范围为 170~1100 nm，动态范围宽，比光电倍增管更耐用。
双波长分光光度计
从光源发出的光经两个单色器，得到两束波长不同的单色光。借切光器调节，使两束光以一定的时间间隔交替照射到盛有试液的吸收池，检测器显示出试液在波长 λ₁ 和 λ₂ 处的透光度差值 ΔT 或吸光度差值 ΔA。
ΔA 与吸光物质浓度 c 成正比，这是用双波长双光束分光光度计进行定量分析的理论根据。
§9-3 显色反应及显色条件的选择
光度分析中，对于本身无吸收的待测组分，先要通过显色反应将待测组分转变成有色化合物，然后测定吸光度或吸收曲线。与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。在光度分析中选择合适的显色反应，并严格控制反应条件，是十分重要的。
显色反应的选择
显色反应多为配位反应或氧化还原反应，而配位反应最常用。同一组分常可与多种显色剂反应，生成不同的有色物质。选用显色反应应考虑以下因素：
（1）灵敏度高
光度法一般用于微量组分的测定，因此选择灵敏的显色反应是主要方面。应当选择生成的有色物质的摩尔吸收系数 κ 较大的显色反应。一般来说，且 κ 值为 10⁴~10⁵ L·mol⁻¹·cm⁻¹ 时，显色反应灵敏度较高。
（2）选择性好
指显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。仅与一种离子发生反应者称为特效（或专属）显色剂。特效显色剂实际上是不存在的，但是干扰较少或干扰易于除去的显色反应是可以找到的。
（3）显色剂在测定波长处无明显吸收
这样，试剂空白值就小，可以提高测定的准确度及降低方法的检测下限。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为对比度，一般要求显色剂与有色化合物的对比度 Δλ > 60 nm。
（4）反应生成的有色化合物组成恒定
化学性质稳定。这样，可以保证至少在测定过程中吸光度基本上不变，否则将影响吸光度测定的准确度及再现性。
显色条件的选择
吸光光度法是测定待测物质的吸光度或显色反应达到平衡后溶液的吸光度，因此为了得到准确的结果，必须控制适当的条件，使显色反应完全、稳定。
显色反应（配位反应）一般可用下式表示：
待测组分 显色剂 有色配合物
根据溶液平衡原理，有色配合物稳定常数愈大，显色剂过量愈多，愈有利于待测组分形成有色配合物。但是过量的显色剂有时会引起副反应，背景值提高，对测定反而不利。显色剂的适宜用量常通过实验来确定。
酸度对显色反应的影响是多方面的。大多数有机显色剂是有机弱酸，且带有酸碱指示剂性质，溶液中存在着下列平衡：
↓ + Men+
MeRn（有色化合物）
酸度改变，将引起平衡移动，从而影响显色剂及有色化合物的浓度，还可能引起配位基团（R）数目的改变以致改变溶液的颜色。显色反应的适宜酸度范围也是通过实验做出吸光度-pH 曲线来确定的。
显色反应一般在室温下进行，有的反应则需要加热，以加速显色反应进行完全。有的有色物质当温度高时又容易分解。为此，对不同的反应，应通过实验找出适宜的温度范围。
大多数显色反应需要经一定的时间才能完成。时间的长短又与温度的高低有关。有的有色物质在放置时，受到空气的氧化或发生光化学反应，会使颜色减弱。因此必须通过实验，做出一定温度下的吸光度-时间关系曲线，求出适宜的显色时间。
光度分析中，共存离子本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。要消除共存离子的干扰，可采用下列方法：
- 加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色配合物或无色离子
- 选择适当的显色条件以避免干扰，如利用酸效应，控制显色剂解离平衡，降低[R]，使干扰离子不与显色剂作用
- 分离干扰离子，在不能掩蔽的情况下，可采用沉淀、离子交换或溶剂萃取等分离方法除去干扰离子
- 选择适当的光度测量条件（适当的波长或参比溶液），消除干扰
显色剂
1. 无机显色剂
无机显色剂与金属离子生成的化合物不够稳定，灵敏度和选择性也不高，应用已不多。尚有实用价值的仅有硫氰酸盐[测定 Fe³⁺、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb(Ⅴ)等]、钼酸铵(测定 P、Si、W 等)及 H₂O₂[测定 V(Ⅴ)、Ti(Ⅳ)等]等数种。
2. 有机显色剂
大多数有机显色剂与金属离子生成稳定的配合物，显色反应的选择性和灵敏度都较无机显色反应高，因而广泛应用于吸光光度分析中。
有机显色剂及其产物的颜色与它们的分子结构有密切关系。分子中含有一个或一个以上的某些不饱和基团（共轭体系）的有机化合物，往往是有颜色的，这些基团称为发色团（或生色团），如偶氮基（—N═N—）、亚硝基（—N═O）、醌基等都是发色团。
另外一些基团，如—NH₂、—NR₂、—OH、—OR、—SH、—Cl 及—Br 等，虽然本身没有颜色，但它们却会影响有机试剂及其与金属离子的反应产物的颜色，这些基团称为助色团。如水杨酸中引入甲氧基后，与 Fe(Ⅲ) 反应产物的最大吸收波长向长波方向移动，颜色也因而加深，这种现象称为"红移"。
§9-4 吸光度测量条件的选择
为使光度分析法有较高的灵敏度和准确度，除了要注意选择合适的显色反应和控制适当的显色条件外，还必须选择和控制适当的吸光度测量条件，主要应考虑如下几点。
入射光波长的选择
入射光的波长一般选择 λmax。因为在 λmax 处摩尔吸收系数值最大，有较高的灵敏度。同时，在 λmax 附近，吸光度变化不大，不会造成对朗伯-比尔定律的偏离，使测定有较高的准确度。
参比溶液的选择
用比色皿测量试液的吸光度，会发生反射、散射、吸收和透射等作用。由于反射、散射以及溶剂和试剂等对光的吸收，造成透射光强度减弱。为了使光强度的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关，必须进行校正。
选择参比溶液的原则如下：
情况一
如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂作参比溶液。
情况二
如果显色剂或其它试剂略有吸收，可用试剂空白溶液（即不加试样，其它试剂、溶剂及操作同样品的测定）作参比溶液。
情况三
如试样中其它组分有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液；当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此作为参比溶液。
吸光度读数范围的选择
吸光度的实验测定值总存在着误差。不同吸光度下相同的吸光度读数误差对测定带来的浓度误差是不同的。
若令式（9-5）的导数为零，可以求出当 T = 0.368（A = 0.434）时，浓度相对误差最小，约为 ±1.4%。
📊 不同透光度下的浓度相对误差
图 9-17 不同透光度下的浓度相对误差
当吸光度 A 在 0.15~1.0 或 T = 70%~10% 的范围内时，浓度测量相对误差约为 ±1.4%~±2.2%，最小误差为 ±1.4%（ΔT = ±0.5% 时）。吸光度过低或过高，相对误差都很大。
实际工作中，应参照仪器说明书，设法使测定在适宜的吸光度范围内进行。可以通过改变吸收池厚度或显色液的浓度，使吸光度读数处在适宜范围内。
§9-5 吸光光度法的应用
吸光光度法主要应用于微量组分的测定，也能用于多组分分析以及研究化学平衡、配合物的组成等，现简要介绍如下。
多组分分析
应用分光光度法，常常可能在同一试样溶液中不经分离而测定一个以上的组分。假定溶液中同时存在 x 和 y 两组分，其吸收光谱一般有如下两种情况：
（1）吸收光谱不重叠
或至少可能找到某一波长处 x 有吸收而 y 不吸收，在另一波长处 y 有吸收而 x 不吸收，则可分别在波长 λ₁ 和 λ₂ 处，测定组分 x 和 y 而相互不产生干扰。这与单组分测定无区别。
（2）吸收光谱重叠
这种情况下，要找出两个波长，使二组分的吸光度差值 ΔA 较大。在波长为 λ₁ 和 λ₂ 处测定吸光度 A₁ 和 A₂，由吸光度的加和性得联立方程：
A₁ = κx₁bcx + κy₁bcy
A₂ = κx₂bcx + κy₂bcy
解方程组可求出 cx 和 cy。
酸碱解离常数的测定
分光光度法可用于测定对光有吸收的酸（碱）的解离常数，是研究酸碱指示剂及金属指示剂的重要方法之一。
此式是用光度法测定一元弱酸解离常数的基本公式
配合物组成及稳定常数的测定
分光光度法是研究配合物组成（配位比）和测定稳定常数的最有用的方法之一。下面简单介绍常用的摩尔比法。
设金属离子 M 与配体 L 的反应生成对光有吸收的配合物 MLn：
配制金属离子浓度 cM 固定，而配体浓度 cL 逐渐改变的系列溶液，并测定它们的吸光度。以吸光度为纵坐标，cL/cM 为横坐标作图。
📈 摩尔比法图示
图 9-21 配合物的摩尔比法图示
双波长分光光度法的应用
多组分混合物的测定
测定试液中 cx 时，选 λ₁ 和 λ₂ 作测定波长和参比波长。y 在两个波长处摩尔吸收系数相等，即 κyλ₁ = κyλ₂，而组分 x 在 λ₁ 处有最大吸收。则 ΔA 与 cx 成正比而与 cy 无关，从而消除了 y 的干扰。
混浊试样的测定
混浊试样由于散射，造成背景吸收较大，但背景吸收随波长变化较小，因而相近两波长的背景吸光度差值近似为零。故选择合适的双波长就能消除背景吸收，这尤其适于生物医学样品的分析。
反应动力学研究
固定两个不同波长，测定两种组分的吸光度随时间的变化。这一方法特别适用于研究反应动力学过程。
§9-6 紫外吸收光谱法简介
紫外吸收光谱法的基础是物质对紫外线的选择性吸收，与可见分光光度法的原理一样，也是基于分子中价电子在能级之间的跃迁所产生的吸收。两者定量分析原理都是依据朗伯-比尔定律，其仪器组成及原理也类似，只是采用氢灯或氘灯作紫外光源，光学材料必须是石英的，检测器应对紫外光有灵敏的响应。
有机化合物电子跃迁的类型
有机化合物的紫外吸收光谱是由于分子中的价电子（σ 电子、π 电子、未成键孤对电子，称为 n 电子）跃迁而产生的。常见的电子跃迁类型为 σ→σ*、n→σ*、π→π*、n→π*，能量高低的顺序为 σ→σ* > n→σ* ≈ π→π* > n→π*。
⚡ 常见电子能级跃迁及对应波长范围和吸收强度
图 9-24 常见电子能级跃迁及对应波长范围和吸收强度
影响紫外吸收光谱的因素
（1）溶剂
溶剂极性的变化会使化合物的紫外吸收光谱形状改变。极性大的溶剂会使 π→π* 跃迁谱带红移，而使 n→π* 跃迁谱带蓝移。
（2）溶剂 pH
当被测物质带有酸性或碱性基团时，溶剂 pH 的变化对光谱的影响较大。例如，苯胺在乙醇中 λmax 为 230 nm，而在稀酸中 λmax 为 203 nm。
（3）空间效应
若分子中存在空间阻碍，影响较大共轭体系的生成，则吸收波长 λmax 较短，κ 小；反之，则 λmax 较大，κ 也增大。
紫外吸收光谱法的应用
紫外吸收光谱法与可见吸收光谱法一样，广泛应用于定量分析，以及用于测定物质的物理化学常数。
进行定性分析时，一是用经验规则计算最大吸收波长 λmax，然后与实测值比较；二是比较吸收光谱。
- 计算 λmax：吸收峰的波长与分子中基团的种类及其在分子中的位置、共轭等情况有关。因此可利用一些经验规则（如 Woodward 规则等）计算共轭分子的 λmax，并与实测值比较。如果相符，则可确定该化合物的种类。
- 比较吸收光谱：在相同的测定条件下，比较未知物与已知标准物的光谱图。若两者的谱图相同，则可认为待测样品与已知标准物含相同的生色团。但有时不一定是同一化合物，因为紫外吸收光谱常只有 2~3 个较宽的吸收峰。所以在比较 λmax 的同时，还要比较 κmax。
反式异构体空间位阻小，共轭程度较高，其 λmax 和 κmax 大于顺式异构体。如顺式 1,2-二苯乙烯的 λmax 为 280 nm，κmax 为 13500 L·mol⁻¹·cm⁻¹；而反式结构的 λmax 为 295 nm，κmax 为 27000 L·mol⁻¹·cm⁻¹。
如果某化合物在紫外光某区域没有吸收峰，而杂质有较强吸收，就可方便地检出该化合物中的痕量杂质。例如，乙醇中有无杂质苯，只要观察在 256 nm 处有无苯的吸收即可，因为苯在此有吸收而乙醇无吸收。
§9-7 分子发光分析法简介
分子发光（molecular luminescence）包括荧光（fluorescence）、磷光（phosphorescence）、化学发光（chemiluminescence）、生物发光（bioluminescence）和分子散射发光。分子发光分析法的显著特点是灵敏度高、选择性好，在化学、医药、生命科学等领域有特殊重要性。
分子荧光分析法
许多化合物会光致发光（photoluminescence），即被光照射后发射出光。荧光一般在光照后 10⁻⁸ s 的时间内发射，而磷光则可延续到 10⁻⁴~1 s 以上的时间。
基于测量化合物荧光的分子荧光分析法（molecular fluorescence spectrometry）灵敏度高，检出限常比分光光度法低一个数量级以上，在 1~100 ng·mL⁻¹ 之间，选择性与其它方法相当或更好，可用于无机物、有机物的测定。因为有些吸光物质无荧光，故荧光分析法不如吸光光度法应用广泛。磷光分析法的应用有限。
1. 分子的激发与失活
多数有机分子含偶数电子，基态时这些电子自旋相反地配对于各原子或分子轨道，所以多数基态分子是单重态（singlet state），磁场中能级不分裂（忽略核自旋效应），有抗磁性。有两个电子自旋不配对而平行的状态称为三重态（triplet state），分子具有顺磁性。
⚡ Jablonski 能级图（光致发光体系的部分能级图）
图 9-27 光致发光体系的部分能级图
2. 激发光谱与发射光谱
任何发射荧光的物质分子都具有两种特征光谱——激发光谱与发射光谱。
- 激发光谱：荧光物质跃迁到激发态时所吸收的光称为激发光，处在激发态的分子回到基态时所发出的荧光称为发射光。
- 如果固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱。
- 如果固定激发光的波长和强度，而不断改变荧光的发射波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图则称为荧光的发射光谱，也称荧光光谱。
3. 荧光强度 F 与浓度的关系
荧光强度与荧光物质的荧光效率 φ（也称荧光量子产率）及所吸收的激发光强度 Ia 成正比，即
对于一定的荧光反应，φ 一定，当入射激发光强度 I₀ 和溶液的厚度 b 一定时，经推导可得
可见，荧光强度与荧光物质浓度 c 呈线性关系
化学发光分析法
化学发光又称冷光（cold light），是由化学反应而产生的光辐射。化学发光分析法是一种新型的分析方法，具有极高的灵敏度[如用荧光素、荧光素酶和三磷酸腺苷(ATP)的化学反应可测定 2×10⁻¹⁷ mol·L⁻¹ 的 ATP]，选择性较好，仪器简单，分析速度快（多在 1 min 之内），线性范围可宽达几个数量级，在环境、医学等领域得到愈来愈广泛的应用。
仅有少数化学反应能满足以下两个条件而发光：
- 反应快速并放出足够的能量，并被反应分子吸收形成一种激发态产物
- 激发态分子或原子能释放出光子，或者能量转移到另一分子再发光
能满足上述两个条件的通常是氧化还原反应，如一氧化氮和臭氧反应的机理为：
NO + O₃ → NO₂* + O₂
NO₂* → NO₂ + hν (600~875 nm)
思考题与习题
思考题
物质对光的选择性吸收是因为不同物质具有不同的分子结构和能级间隔。只有当入射光的能量恰好等于分子两个能级之差时，光子才能被吸收。
常见的电子跃迁类型有：σ→σ*、n→σ*、π→π*、n→π*
朗伯-比尔定律表明：当一束平行单色光通过均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和光程的乘积成正比。
透射率 T = I/I₀，表示透射光强度与入射光强度之比。
吸光度 A = -lgT = lg(I₀/I)，二者关系为 A = -lgT。
摩尔吸收系数 κ 的物理意义是浓度为 1 mol·L⁻¹ 的溶液在 1 cm 光程时的吸光度，表示物质对光的吸收能力。
κ 与物质的性质、入射光波长、溶剂等因素有关，与浓度和光程无关。
在分析化学中，κ 可用于：①定性鉴定；②估计方法灵敏度；③比较不同显色反应的灵敏度。
吸收光谱曲线是吸光度 A 对波长 λ 的关系曲线，用于选择测定波长和定性分析。
标准曲线是吸光度 A 对浓度 c 的关系曲线，用于定量分析。
不宜使用 T-c 曲线，因为 T 与 c 是指数关系而非线性关系，会增大测量误差。
习题
将 0.088 mg 的 Fe³⁺ 用硫氰酸盐显色后，在容量瓶中用水稀释到 50 mL，用 1 cm 比色皿在 480 nm 波长处测得 A = 0.740。求吸收系数 a 及 κ。
用双硫腙光度法测定 Pb²⁺。Pb²⁺ 的浓度为 0.08 mg/50 mL，用 2 cm 比色皿在 500 nm 波长处测得 T = 53%，求 κ。
用磺基水杨酸法测定微量铁。标准铁溶液是由 0.216 0 g NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O（铁铵矾，M = 482.18 g·mol⁻¹）溶于水中稀释至 500 mL 配制成的。根据下列数据，绘制标准曲线。
| 标准铁溶液的体积/mL | 0.0 | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 吸光度 | 0.0 | 0.165 | 0.320 | 0.480 | 0.630 | 0.790 |
某试液 5.00 mL，稀释至 250 mL。取此稀释液 2.00 mL，与绘制标准曲线相同条件下显色并测定吸光度，测得 A = 0.500。求试液铁含量（单位：mg·mL⁻¹）。
某含铁约 0.2% 的试样，用邻二氮菲-亚铁光度法（κ = 1.00×10⁴ L·mol⁻¹·cm⁻¹）测定。试样溶解后稀释至 100 mL，用 1 cm 比色皿在 508 nm 波长处测定吸光度。
（1）为使吸光度测量引起的浓度相对误差小，应当称取试样多少克？
（2）如果所使用的光度计透光度最适宜读数范围为 0.200~0.650，测定溶液应控制的铁的浓度范围为多少？
英汉对照词汇
复习本章的指导提纲
基本概念
吸光度、透射率、摩尔吸收系数、吸收光谱、最大吸收波长、朗伯-比尔定律、补色、显色反应、显色剂、发色团、助色团、荧光、磷光、化学发光、单重态、三重态、激发光谱、发射光谱。
基本知识点
- 物质对光的选择性吸收原理与互补色关系
- 朗伯-比尔定律的数学表达式及各参数的物理意义
- 摩尔吸收系数的意义及其在分析化学中的应用
- 偏离朗伯-比尔定律的原因（非单色光、化学因素）
- 分光光度计的基本组成部件及其作用
- 显色反应和显色条件的选择原则
- 测量条件的选择（波长、参比溶液、吸光度范围）
- 多组分分析的原理与方法
- 紫外吸收光谱法中电子跃迁的类型及影响因素
- 分子荧光分析法的基本原理（激发与失活、光谱特征）
- 化学发光分析法的基本原理与条件